پایان نامه ارزيابي ميزان توليد داروي دسفرال از سويه استرپتومايسس پيلوسوس به روش بيولوژيك

توضیحات

    پایان نامه ارزيابي ميزان توليد داروي دسفرال از سويه استرپتومايسس پيلوسوس به روش بيولوژيك




فهرست مطالب

عنوان    صفحه
چكيده    1
مقدمه    3
فصل اول
1-1 - تالاسمي    8
1-2-اتيولوژي و سبب شناسي تالاسمي    8
1-2-1 - خون شناسي    9
1-2-2- خون سازي و گلبولهاي قرمز    10
1-3- تالاسمي و انواع آن    10
1-3-1 آلفا تالاسمي    10
1-3-2- بتا تالاسمي    11
1-3-2-1 بتا تالاسمي مينور(سالم ناقل)    11
1-3-2-2 – بتا تالاسمي ماژور( بيماري تالاسمي)    12
1-3-2-3-بتا تالاسمي بينابيني    13
1-4- تشخيص تالاسمي    13
1-5- درمان تالاسمي    13
1-6- فيزيولوژي عنصر آهن و اهميت آن در بدن انسان    14
1-6-1- مسموميت حاد آهني    15
1-7- دسفرال    16
1-7-1- نحوه استفاده از داروي دسفرال    17
1-7-2-كاربردهاي داروي دسفرال در پزشكي    18
1-7-3- عوارض ناشي از داروي دسفرال    19
1-7-4- اقدامات احتياطي در مورد داروي دسفرال    19
1-7-5- ملاك توقف درمان بوسيله دسفرال    20
فصل دوم
2-1-  سيدرو فورها    22
2-1-1- هيدروكسامات ها    24
2-1-2-فنولات ها يا كاتكولات ها    25
2-2- دسفري اكسامين ها    26
2- 2-1 – ساختمان دسفري اكسامين    28
2-2-2- دسفراكسامين بصورت آنتي اكسيدان    28
2-2-3 – خصوصيات فيزيكو و شيميايي دسفراكسامين    29
2-2-4- مكانيسم دسفراكسامين در جلوگيري از بيماريهاي با بار اضافي آهن    29
2-2-5- تشكيل راديكال  DFO nitroxide    30
2-3-  دسفري اكسامين B    31
2-3-1- بيوسنتر دسفري اكسامين B    33
2-3-2- ژنهاي كد كننده دسفري اكسامين B    33
2-4- توليد كننده¬هاي دسفري اكسامين    34
2-5- اهميت آهن بر روي ميكروارگانيسمها    35
2-6- مكانيسم عمل سيدروفورها در ارتباط با انتقال آهن به درون سلول ميكروارگانيسمها    36
2-7- توليد، استخراج و تخليص دسفري اكسامين B    37
فصل سوم
3-1- اكتينوميست ها    40
3-2- استرپتومايسس ها    43
3-2-1- پاتولوژي    43
3-2-2 – مرفولوژي و ساختمان    43
3-2-3- مشخصات كلني    454
3-2-4- اسپورزايي    47
3-2-5- تركيبات پوشش سلولي    49
3-2-6- تغذيه و فاكتورهاي موثر بر رشد و خصوصيات فيزيكوشيميايي    49
3-2-6-1- تغذيه    49
3-2-6-2- اكسيژن    50
3-2-6-3 - رطوبت    50
3-2-6-4- دما    51
3-2-6-5- pH    51
3-2-6-6- اكولوژي    52
3-2-6-7- بيولوژي توسعه يافته استرپتومايسس    53
3-2-7- انواع فرآورده هاي ميكروبي    56
3-2-7-1- متابوليت هاي اوليه    56
3-2-7-2- متابوليت هاي ثانويه    56
3-2-7-2-1- آنتي بيوتيك ها    58
3-2-7-2-1-1- فيزيولوژي و تنظيم توليد آنتي بيوتيك    58
3-2-7-3- آنزيمها    63
3-2-7-3-1- پروتئازها    63
3-2-7-3-1-1- پروتئازهاي اسيدي    67
3-2-7-3-1-1-1- رنين    67
3-2-7-3-1-2- پروتئازهاي خنثي    67
3-2-7-3-1-3- پروتئاز های قلیایی    67
3-2-7-3-1-3-1- فرآیند تخمیر پروتئازهای قلیایی    68
3-2-7-3-1-3-2- تعیین فعالیت پروتئاز قليايي    69
3-2-7-3-1-4- بازدارنده های فعالیت آنزیم پروتئاز وشلاته کننده ها    69
3-2-7-3-1-5- تجزیه    71
3-2-7-3-1-6- پروتئاز ها و استرپتومایسسها    71
3-2-8- محيط كشت  تخمیر صنعتی    71
3-2-8-1- نيازهاي غذايي ميكروارگانيسم‌ها    71
3-2-8-1-1- كربن    74
3-2-8-1-1-1- منابع کربن و استرپتومایسس ها    77
3-2-8-1-2-نيتروژن    78
3-2-8-1-2-1-  منابع نيتروژن و استرپتومايسس ها    80
3-2-8-1-3- هيدروژن و اكسيژن    80
3-2-8-1-4- مواد معدني    80
3-2-8-2-تنظيم كننده هاي متابوليكي    81
3-2-8-3- ضد كف ها    82
3-2-9- بیوسنتز  در استرپتومايسس ها    83
فصل چهارم
4-1- دستگاه هاي مورد استفاده    86
4-2- وسايل مورد استفاده    86
4-3 - محيط هاي كشت مايع براي رشد باكتري    88
4-4- محيط هاي كشت جامد براي رشد باكتري    89
4-5- محيط هاي جامد براي توليد اسپور    89
4-6- مواد لازم جهت رنگ آميزي گرم    90
4-7- مواد لازم جهت استفاده از ميكروسكوپ نوري    91
4-8- محيط مورد استفاده جهت شناسايي كيفي دسفري اكسامين: محيط Des4    91
4-9- محيط مورد استفاده جهت اندازه گيري توليد دسفري اكسامين محيط Soy bean     91
4-10- مواد لازم جهت نگهداري و ذخيره باكتري ها    92
4-11- معرف هاي دسفري اكسامين    92
4-12- مواد لازم جهت رسم منحني استاندارد دسفري اكسامين B    92
4-13- مواد لازم جهت استخراج دسفري اكسامين    92
4-14- مواد لازم جهت تهيه محلول Lysing Buffer    93
4-14-1 – مواد لازم جهت تهيه محلول Tris Hcl    93
4-15- محلول كازئين %5/0 دربافر فسفات    93
4-15-1- بافر فسفات (PBS)    93
4-16- محلول لوري (Lowry)    93
فصل پنجم
5 – ١- تهيه و آماده سازي سويه استرپتومايسس پيلوسوس    98
5 ـ ٢ ـ بررسي خصوصيات مرفولوژيكي سويه استرپتومايسس پيلوسوس    98
5-٢-١- خصوصيات ماكروسكوپي    99
5- ٢-١-١- كشت استرپتومايسس پيلوسوس بر روي محيط جامد    99
5-٢-١-٢- كشت استرپتومايسس پيلوسوس در محيط مايع    99
5-٢-٢ خصوصيات ميكروسكوپي    99
5-٢-٢-١- تهيه لام از محيط كشت جامد    99
5-٢-٢-٢- تهيه لام از محيط كشت مايع    100
5ـ ٢ـ٢ـ ٣ـ رنگ آميزي گرم    100
5 ـ ٣ـ تهيه مايع تلقيح    100
5 ـ ٣ـ ١ـ تهيه محيط ذخيره    101
5 ـ ٣ـ ٢ـ تهيه سوسپانسيون اسپور    101
5ـ ٤ـ رسم منحني رشد استرپتومايسس پيلوسوس    101
5ـ ٥ـ بررسي تغييرات  pH در محيط كشت Soybean    102
5ـ ٦ـ توليد دسفري اكسامين توسط استرپتومایسس پيلوسوس    102
5ـ ٦ـ ١ـ تشخيص كيفي دسفري اكسامين    102
5ـ ٦ـ ٢ـ سنجش ميزان توليد دسفري اكسامين در هر روز    103
5-6-3- رسم منحني استاندارد دسفرال    103
5-٧ـ استخراج دسفري اكسامين بوسيله فنل-كلروفرم    104
 5 ـ ٧ـ ١ـ مزتیله كردن دسفري اكسامين    105
5-8- تعيين وجود دسفري اكسامين B در ماده استخراج شده    105
5ـ ٩ـ  بهينه سازي محيط كشت توليد دسفري اكسامين    107
5ـ ٩ـ ١ـ بررسي اثر اسيد آمينه ترئونين بر توليد دسفري اكسامين    107
5 ـ ٩ـ ١ـ ١ـ بررسي اثر اسيد آمينه ترئونين بر توليد دسفري اكسامين در يك محدوده غلظت    107
5ـ ٩ـ ٢ـ بررسي اثر اسيدآمينه ترئونين و اسيد آمينه لوسين و ويتامين تیامینB1)  ( برتوليد دسفري اكسامين     108
5 ـ ٩ـ ٣ـ بررسي گلوكز و ملاس و سوكروز بر توليد دسفري اكسامين    108
5ـ ٩ـ ٤ـ بررسي اثر شلاته كننده هاي كاتيون بر تولید دسفری اکسامین    108
5 ـ ٩ـ ٥ـ  استفاده از محيط كشت عصاره مخمر به جاي استفاده از محيط كشت Soybean    109
5 ـ ٩ـ ٦ـ بررسي اثر مواد معدني مختلف بر ميزان توليد دسفري اكسامين    109
5 ـ٩ـ٦ـ١ـ بررسي تاثير مواد معدني در غلظت هاي مختلف بر ميزان توليد دسفري اكسامين    111
5 ـ ١٠ - بررسي پروتئاز توليدي از استرپتومايسس پيلوسوس در حضور شلاته  كننده ها و مواد معدني مختلف    112
5 ـ ١٠ـ ١ـ كشت باكتري و سنجش پروتئاز    112
5 ـ ١٠ـ 2ـ تخليص كازئين    113
فصل ششم
6ـ ١ـ بررسي خصوصيات مرفولوژيكي ماكروسكوپي استرپتومایسس پيلوسوس    115
6ـ ١ـ ١¬ـ خصوصيات ماكروسكوپي سويه استاندارد بر روي محيط كشت جامد    115
6 ـ ١ـ٢ـ خصوصيات ماكروسكوپي سويه استاندارد در محيط كشت مايع    115
6 ـ ٢ـ بررسي خصوصيات مرفولوژيكي ميكروسكوپي استرپتومایسس پيلوسوس    116
6 ـ٣ـ رسم منحني رشد استرپتوماسيس پيلوسوس در محيط كشت MYB    116
6-4- رسم منحني pH بر حسب زمان در محيط كشت Soybean حاوي سويه استرپتومايسس پيلوسس    118
6 ـ ٥ـ تشخيص كيفي و كمي دسفري اكسامين توليدي    120
6-5-1- تشخيص كيفي و توليد و يا عدم توليد دسفري اكسامين    120
6ـ٥ـ2ـ رسم نمودار استاندارد دسفرال    120
6ـ٥ـ3ـ میزان دسفري اكسامين توليدي در هر روز توسط سویه استرپتومایسس پیلوسوس در محيط Soy bean    121
6-6- نتايج مربوط به استخراج دسفري اكسامين توليد شده توسط سويه استرپتومايسس پيلوسوس    122
6-6-1- نتايج مربوط به تأييد وجود دسفري اكسامين B در ماده استخراج شده    122
6-7-  بهينه سازي محيط كشت توليد دسفري اكسامين    124
6-7-1  بررسي اثر اسيد آمينه ترئونين بر توليد دسفري اكسامين    124
6-7-1-1- بررسي اثر اسيد آمينه ترئونين بر توليد دسفري اكسامين در يك محدوده غلظت    124
6ـ7ـ ٢ـ بررسي اثر اسيد آمينه هاي ترئونين و لوسين و ويتامين تيامين (B1 )    126
6 ـ 7ـ٣ـ بررسي گلوكز ، ملاس، سوكروز بر توليد دسفري اكسامين    126
6ـ 7ـ ٤ـ بررسي اثر شلاته كننده هاي كاتيون بر ميزان توليد دسفري اكسامين    127
6ـ 7ـ ٥ـ استفاده از محيط كشت عصاره مخمر به جاي استفاده از محيط كشت Soybean    128
6 ـ 7ـ ٦ـ بررسي اثر مواد معدني مختلف بر ميزان توليد دسفري اكسامين    128
6 – 7 – 6 – 1 – بررسي اثر مواد مختلف با غلظت متفاوت بر ميزان توليد دسفري اكسامين     130
6ـ8ـ بررسي پروتئاز توليدي از استرپتومايسس پيلوسوس در حضور شلاته‌كننده و مواد معدني مختلف    139
فصل هفتم
- بحث و نتيجه گيري    143
- پيشنهادات    147
- فهرست منابع    149
 
چكيده  
دسفري اكسامينB،‌ تنها سيدروفوري است كه فرم مزتيله آن (نمك متان سولفونات دسفري اكسامين B) با نام تجاري دسفرال جهت درمان بيماران تالاسمي، به منظور شلاته كردن بار اضافي آهن، استفاده مي گردد.
به همين منظور جهت توليد دسفري اكسامين B، از سويه استرپتومايسس پيلوسوس استفاده گرديد و سويه مربوطه در محيط كشت Soy bean كشت داده شد و دسفري اكسامين آن بوسيله استفاده از محلول فنل- كلروفرم و اتر استخراج گرديد. به منظور طراحي اين سيستم بيولوژيكي و افزايش بهره برداري از محصول مذكور از منابع كربن و نيتروژن مختلف استفاده گرديد و تاثير هر يك بر ميزان دسفري اكسامين توليدي بررسي شد. چنانچه مشاهده گرديد كه اسيد آمينه ترئونين، افزايش قابل ملاحظه اي بر دسفري اكسامين توليدي از سويه مذكور دارد و مقدار 5/0 ترئونين، در محيط كشت Soy bean، بسيار مطلوب مي باشد. از طرفي اثر ويتامين تيامين (B1)بررسي گرديد و مشاهده شد كه تاثير مثبت بر دسفر اكسامين توليدي دارد و در رده بعد از اسيد آمينه ترئونين قرار مي گيرد. همچنين اثر اسيد آمينه لوسين نيز بر توليد دسفري اكسامين مثبت بوده و در رده بعد از ويتامين تيامين (B1) قرار مي گيرد.